實驗動物健康監測假陽性、假陰性結果判讀技巧

梁鍾鼎 首席科學家 

諾和諾德中國研發中心

 

一般隔離區較易受病毒污染，其污染率約以每週 0.17% 的速度在進行，而隔離操作箱 (isolators) 易受細菌污染，尤其是葡萄球菌，污染率以每週 2% 的速度在進行 (Weisbroth et al., 1998)。

動物健康監測常用的 ILAR 公式 (Nicklas et al., 2002):即 log 0.05/log N = 採樣隻數；0.05 表示 95% 可信度，N 表示族群中未感染動物的比率 (%)。但是前提是開放籠盒，疾病沒有性別上的差異，族群隻數大於 100 隻，隨機採樣，感染呈隨機分布。假設現在某單位有 100 隻大鼠，其中已知以酵素免疫吸附法 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 測得的大鼠冠狀病毒又稱唾液腺淚腺炎病毒 (Sialodacryoadenitis virus, SDAV) 抗體陽性有 35 隻，65 隻動物呈抗體陰性結果。所以當我們抽驗第 1 隻時，測到抗體陽性的機率為 0.35 (35/100)，0.65 (65/100) 的機率會呈陰性。

當第 1 隻結果是陰性時，表示仍然有 35 隻陽性鼠在此族群中，所以第 2 隻抽驗時，得到結果為陽性的機率為 35/99，結果為陰性的機率為 64/99；如果第 2 隻結果仍是陰性時，表示第 3 隻抽驗時，得到結果為陽性的機率為 35/98，結果為陰性的機率為 63/98；經連續 3 次，在此一族群中無法偵測到 SDAV 的機率為 65/100 × 64/99 × 63/98，即 27.4%；72.6% 的機率呈檢測陽性。依此類推，經連續 7 次的檢測，仍未發現 SDAV 的機率為 4.35%；即 95.65% 的機率能檢出陽性，如果 SDAV 真的存在。

理論上，所有的檢測在假陰性 (False negative, FN) 及假陽性 (False positive, FP) 結果上應為零，但我們知道那是不可能的事，且會有假陽性及假陰性發生。假陰性可能的原因包括：血清學 (動物呈病原急性期感染，抗體未上昇；動物是免疫缺陷鼠；虛弱或未成年)；細菌及寄生蟲檢查 (動物已康復；檢測部分病原不存在；動物年齡不對，如原蟲感染較易在離乳鼠檢查出，而成年鼠不易檢出)。其它原因包括採樣數目太少，監測鼠並未接觸到主要宿主的髒墊料，使用方法不對[(例如使用髒墊料方法對監測仙台病毒 (Sendai virus)，及纖毛協同桿菌 (Cilia-associated respiratory bacillus) 無效 (Weisbroth et al., 1998)]。

假陽性可能的原因包括：血清學 (品系有自體免疫疾病，曾注射生物性材料，如細胞株或腫瘤細胞，這些生物材料帶有病原)；移行抗體，其它原因包括實驗人為誤差，樣品稀釋錯誤，機器沖洗未洗淨，影響吸光值，未依照標準操作程序 (Standard operating procedures, SOPs)。當然我們也可以監測的數據來判定是否結果為假陽性。當族群中的所有已感染動物所占所有動物之比率稱之為感染率 (prevalence, PV) ，而陽性結果的預期值 (Pv+)，表示所有監測之陽性結果中，真陽性 (TP) 所佔的比率：PV (+) = 〔TP/(TP + FP)〕× 100；Prevalence (PV) = (TP+FN)/Total population〕× 100 (表一)。所以當監測結果顯示其感染率 (PV) 較低時，PV(+) 值亦隨之下降。也就是說當族群中某疾病感染率非常低，小於 1% 以下時，或 ELISA 檢測結果接近臨界值時，陽性結果存疑或不正確的機率相當高。例如檢出諾如病毒陽性 (MNV)，可信度高；相反如果血清學出現仙台病毒陽性，則可信度低。ELISA  敏感性一般在 0.1 ~ 1 fmole 或 0.01 ~ 0.1 ng 之間。也就是說，例如當族群感染率 10%，陽性預期值 68.5%，當出現陽性結果時，31.5% 可能不正確。當族群感染率 1%，出現陽性結果，僅 16.5% 正確 (Weisbroth et al., 1998)。

 

陽性結果出現時，這時候我們必須採取一些措施，其步驟為 (Shek et al., 2015; Weisbroth et al., 1998) ：重新以同一方法 (例如ELISA) 再重覆測試此一陽性檢體。如果結果為陰性，可能表示此陰性為真正結果，如果結果呈陽性，必須以第二種方法檢測，如間接螢光抗體法 (Indirect fluorescent antibody test, IFA) 或聚合酶連鎖反應 (PCR)。如果第二種方法檢測呈陽性，可能表示第一種方法結果為真，此時須再大量篩檢，且將預期感染率降低，原來如果設定為預期感染率 30%，採樣 9 隻，此時可擴大採樣至每房間 14 隻 (預期感染率 20%) ，或100 隻 (預期感染率 3%) 。血清學等監測方法較適用於感染率較高的情況 (Nicklas et al., 2002)。當判讀結果真假之前，通常原則是血清學結果呈 ELISA 抗體力價昇高或許多隻動物皆呈同一病原抗體陽性時，監測結果較可能為真 (Clifford CB, 2001) 。

有一次，有一個醫學院博士生帶著一盒腦部 HE 切片找我，說想請我判讀大小鼠腦病變是否與人類失智症病變類似，我問他腦部的切片處理過程，之後只回了他一句：「您整盒切片可以丟掉了。」，其實這個假病變叫暗黑色皺縮神經元 (dark shrunken neurons)，三十年前就已經有人發表 (Loberg & Torvik, 1993)，常出現於未灌流的大小鼠腦部，包括大腦皮質、海馬角、小鼠浦金氏細胞 (Purkinje cells) 等神經元細胞，HE 染色下呈嗜鹼性，黑至紫色，皺縮 (圖一)。必須要和真正的神經元細胞死亡區分，但是現在判讀時，仍把其當作神經元死亡。此假病變只有在大小鼠安樂死後，心臟仍跳動，立即剪開右心房，由心臟左心室灌流 Bouin's 溶液可解決。

 

執行 IVC 籠盒髒墊料哨兵鼠健康監測時，此法與前述不同，且此方法有其限制，例如下列這些病原：Sendai virus, LCMV, LDV, Spironucleus muris, Rodentibacter pneumotropicus及 R. heylii，和皮毛恙蟲無法藉由糞口傳染，常會呈假陰性而誤判。使用哨兵動物，這些病原也非常難檢測，例如 Adenovirus, 黴漿菌 (M. pulmonis), Cryptosporidium,梨形蟲 (Giardia spp.) 等或不穩定的陽性檢出率，例如 螺桿菌 (Helicobacter spp.), P. aeruginosa, TMEV, MNV, 蟯蟲等 (Clifford et al., 2014) 。曾有報告指出以 10 個棉絨拭子或濾紙在沒有哨兵動物存在的盒設置初期，即隨意放入髒墊料中，90 天後再放入 10 個新的棉絨拭子混合，結果發現即使不放哨兵動物，這些非生物性材料也能藉由 PCR 方法診斷出小鼠諾如病毒 (MNV)、螺桿菌及皮毛恙蟲 (Radfordia affinis)  (Hanson et al., 2021) 。其成功檢測率比較以放入 3 個月棉絨拭子最佳，其次是新放入的拭子，第三為濾紙。類似方法取代了傳統依賴活體哨兵動物健康監測的方法 (O'Connell et al., 2021) 。

健康監測常用血清學抗體 (ELISA)，作為第一線檢查工具，但這只能用於病毒，對細菌診斷不適合。例如泰瑞氏病 (Tyzzer's Disease)，是一種梭菌 (Clostridium piliforme) 引起，造成肝臟多發壞死，如果用血清學易誤診，因為細菌抗原比較繁雜，所以易有假陽性反應。如果血清學呈陽性反應，請務必執行緊迫測試，即將懷疑種群大鼠注射免疫抑制劑 (cyclophosphamide)，如果此時大鼠沒有出現臨床症狀，很可能血清學為假陽性反應或者動物感染非毒性的細菌株。可以使用糞材 PCR 檢查來確定是否有細菌增生，同時必須區分麻醉劑水化氯醛 (Chloral hydrate) 造成的迴腸擴張與感染此菌非常類似 (Sharp & Villano, 2013)。間接螢光抗體法 (IFA)，是主要的第二線診斷方式，每種病毒細胞螢光反應部位亦不同，大部分 DNA 病毒，螢光出現於細胞核內，例如 MPV, Mad, MTLV, RPV 等。RNA 病毒，螢光出現於細胞質內，例如 MHV, MNV, SDAV, PVM 等，一些特例則兩個位置皆出現螢光，例如 H-1, KRV, MVM 等。黴漿菌螢光出現於細胞膜表面 (圖二)，判讀陽性感染時需注意這些病原的特異螢光位置。同時如果超過 50% 細胞以上出現螢光反應，須判定為非特異性假陽性。

 

一般如果使用髒墊料哨兵鼠監測，一籠 2 ~ 3 隻哨兵鼠可負責監測 50 ~ 80 IVC 籠髒墊料。哨兵動物建議使用遠交族群 CD-1 小鼠或 SD 大鼠，不要用近親品系，如 C57BL/6 小鼠對細小病毒 (MPV) 感染有抵抗性；SJL 小鼠對小鼠肝炎病毒 (MHV) 有抵抗性；DBA/2 小鼠抗體產生延緩。哨兵動物建議選用母鼠，3 ~ 5 周齡即放入籠內接觸髒墊料，因為抗體產生需要 7 ~ 14 天，所以送檢動物必須在送檢前 2 周能夠接觸負責區內髒墊料 2 次以上，比較能暴露潛在病原，甚至有些病原如諾如病毒，哨兵鼠需接觸髒墊料 8 周以上才易檢出 (Clifford et al., 2014)。哨兵動物年齡在 4 ~ 8 周齡易檢出腸道原蟲；8 ~ 10 周齡易檢出蟯蟲 (pinworms)；10 ~ 12 周齡易檢出肺囊蟲黴菌 (Pneumocystis carinii)。十二指腸黏膜刮取物比較易診斷出梨形蟲及螺旋蟲 (Spironucleus spp.) 。盲腸內容物易檢出腸道鞭毛蟲及阿米巴原蟲。糞便離心及濃縮法比浮游法敏感。如果使用肉眼檢查，泡軟的盲腸及結腸易檢出仔幼蟲及成蟲，同理小腸易檢出絛蟲，但需使用立體顯微鏡，毛皮恙蟲易發現於頸背側，耳朵周圍及臉部皮毛樣品 (Henderson et al., 2022) 。

現在診斷方式已經由多源免疫螢光法 (Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay™，MFIA™) (Wunderlich et al., 2011)，取代傳統的 ELISA 及 IFA。但傳統方法仍有存在的必要性，例如 MTLV 仍以 IFA 為第一線方法。外寄生蟲、蟯蟲、螺桿菌等不易培養的細菌已漸由 PCR 取代傳統鏡檢及培養 (Henderson & Clifford, 2013)，因為更敏感。 總之一句話，(1). 樣本量是否足夠；(2). 檢測方式敏感性及特異性是否足夠；(3). 是否有足夠的陽性樣品? 及抗體力價是否高? 或是在臨界值? 在未確定結果真假之前，先不採取行動。

實驗動物健康監測也是國際實驗動物設施認可委員會 (AAALAC International) 所關心的議題，在此祝各位順心。

 

參考文獻

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