MMA 塑膠包埋切片-骨、牙等硬組織暨植入性醫材研究的理想病理技術方案

    張皓凱 主任病理獸醫師

BioTnA同人科技股份有限公司

立眾病理實驗室

        組織病理技術 (histopathology technique) 讓研究者透過組織脫水、包埋、薄切片及化學染色，能在細胞層級有效的觀察動物或植物組織，在生物醫學領域中應用已久，且一直扮演重要的角色。福馬林固定石蠟包埋 (formalin fixed paraffin embedded, FFPE) 組織是其中最廣泛被應用的技術，配合蘇木紫-伊紅 (hematoxylin-Eosin, H&E) 染色製成 3-5 μm 的薄切片，即是現今用於診斷、分析的標準方法³。FFPE 中的石蠟包埋是利用石蠟具有相對較低的融點，使液態石蠟能填充組織脫水後的空隙，並在冷卻硬化後提供支撐組織的功能。相較於其它具熱塑性的物質，石蠟因融點及軟硬度適中，且能有效的保存組織的生物化學特性，因此被廣泛的使用。但受限於石蠟本身的硬度，硬度較高的動物組織，如骨或牙齒等就必須先經過脫鈣 (decalcification)、軟化處理。如組織中有植入性醫材，如骨釘、牙材、血管支架等，在進行組織學的研究時亦需要先行移除植入物後才能進行組織切片製作。然而，不論是脫鈣處理或是移除植入物，都會造成組織結構或化學特性的人為破壞，必然導致後續組織化學 (histochemistry) 染色，或病理分析上的失真。為解決石蠟包埋的硬度不足問題，進一步發展出使用更為硬實的塑膠介質進行包埋的技術。

       塑膠包埋技術在 1980 年代即開始有相關的研究文獻出現，旨在解決石蠟包埋的硬度不足問題。截至今日，骨或牙齒等富含鈣的硬組織如欲進行石蠟包埋切片時，皆必須先進行脫鈣處理，而常見的脫鈣處理方法如甲酸、EDTA 等，皆會造成組織生化特性、蛋白質抗原性的嚴重破壞，導致後續的組織化學染色及免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC) 染色難以進行。且鈣的分佈對骨代謝相關疾病、骨修復反應的研究皆是重要資訊，因此未脫鈣組織切片 (undecalcified bone section) 即是骨科學研究中的重要課題之一⁷。現今，用於塑膠包埋切片的包埋介質中，較常見者有甲基丙烯酸甲酯 (methyl methacrylate, MMA)、水溶性甲基丙烯酸酯 (glycolmethacrylate, GMA)、乙烯基丙烯酸酯 (ethylene vinyl acetate, EVA)、環氧樹脂 (epoxy resin) 或聚乙二醇 (polyethylene glycol, PEG) 等。其中 MMA 因以下幾項特點而成為目前較為主流的包埋方法：

1. 較佳的組織滲透性：未硬固的 MMA包埋試劑在室溫下具有良好的流動性及滲透性，能較理想的完整浸潤組織，使組織中不至於有過多空隙存在。且  MMA  不需要高溫或極低溫環境下進行硬固，也因此減少對組織蛋白質的破壞。
2. 優異的高透明度：使組織在製成包埋塊後，仍然良好的被觀察。使切片技術人員能有效的調整切片角度，以獲得最佳的切面 (圖1、 A.B.)。且因足夠的透明度及均勻的組織浸潤，切片成品也能很好的確認是否有正確的切面 (圖1、C)。
3. 相對易於從組織上脫去：不同於石蠟組織切片，在製成薄切片後，塑膠介質相對較難以脫去，因此會造成後續染色上的困難。MMA 包埋組織雖亦難以單純使用二甲苯 (xylene) 完全脫去，但配合其它適當的有機溶劑處理下，MMA 仍相對於其它塑膠介質更易於完整去除，使後續染色的表現較佳¹。
4. 足夠的硬度及彈性：相較於 GMA 或PEG 等高彈性但硬度較低的介質，MMA 的彈性及硬度較為適中，且能根據技術人員的需要對硬化程度進行適當的調整，此項特性使MMA能應用於大部份的硬組織切片及植入性醫材。MMA 包埋組織能在不脫鈣的情形下，製成厚度 10 μm 以下的硬組織薄切片外， 亦能在不移除骨釘等堅硬植入性醫材的情形下，使用精密慢切機製作厚度約 100 μm 的研磨片²。因 MMA 足夠的硬度，甚至在無植入物的小型組織中，能進行超薄切 (1 μm) 切片製作，可應用在如中耳、內耳或眼球的細微節構觀察。
5. 良好保存組織的生化特性及結構：透過 MMA 包埋，因不需經過脫鈣處理，組織的 pH 值及蛋白質特性能較好的被保存。且因能夠連同植入性醫材一併切割，不需先行拔除醫材，不會造成植入部份的結構破壞。此項優勢配合 H&E (圖 2)、Von Kossa (圖 3)、Alizarin Red或 Masson Trichrome (圖 4) 等化學染色方法，即能分析包含細胞種類、鈣分佈、膠原纖維分佈等組織與醫材間的交互反應，亦能透過使用 IHC 或免疫螢光 (immunofluorescence, IF) 染色，獲得蛋白質表性等資訊。

因上述的優勢，塑膠包埋切片相較於傳統的石蠟組織，更能完整的觀察分析硬組織生化特性，且能有效的分析植入性醫材與周圍組織間的反應，故被規範必須用於醫療器材生物相容性試驗 ISO 10993 的組織病理學分析 ^{4, 5, 6}。

      然而，MMA 包埋雖然有前述的優點而在硬組織的病理技術上不可或缺，但也有相應的技術難題使其至今仍難以普及於各組織病理實驗室。

1. 毒性安全危害：MMA 相對傳統石蠟，其包埋試劑原料具高度的毒性安全危害。MMA 試劑原料本身具高度揮發性，對呼吸道、皮膚及中樞神經皆有毒性，使實驗室在抽氣設備應有較高的規格，且操作及人員訓練上皆需要相對嚴格的要求。
2. 曠日費時的組織包埋處理程序：在進行初步的組織脫水處理後，MMA 在試劑的浸潤及包埋程序上相對於石蠟需要更久的時間及更複雜的步驟，往往需要數日乃至數週。除了需要在更為真空的環境下避免氣泡的產生，且因 MMA 的硬度會隨包埋的環境條件而有相當大的差異，如何使包埋塊硬化至適當的程度亦是相對較高的技術門檻。
3. 高昂的設備成本：因 MMA 包埋組織塊硬度遠高於常規石蠟包埋組織塊，一般用於製作石蠟切片的切片機及刀片無法用於 MMA 包埋組織，須使用特製的鎢鋼刀才能進行切片製作 (圖 5)。如有更為硬實或大型的植入性醫材，則須使用鑽石刀精密慢切機 (圖6) 才能進行切割。
4. 高度的切片技術要求：因檢體本身的硬度及設備的不同，其切片技術與常規的石蠟組織切片亦大相徑庭，多數組織切片技術人員並不具備這項技能，也因此難以培養相關技術人員。
5. 染色技術困難：雖MMA相對於其它塑膠包埋方法，已較易於將介質從組織上脫去，但方法及技術上仍較常規石蠟更為複雜且困難。另外因骨組織及醫材本身的特性，難以良好的貼附於各種載玻片上，亦增加染色的困難度。

       除上述技術問題外，塑膠包埋切片在病理分析上亦有相當的困難。ISO 10993 中對於組織病灶分析有相當規範，其評估項目除了植入物是否被吸收外 (implant absorption)，須分析評估的項目尚包含巨噬細胞的吞噬反應 (phagocytosis) 及各種類炎症細胞量⁶。然因 MMA包埋硬組織切片，在有植入物、或檢體較大的情形下，其薄度極限難以達到石蠟的標準。另因細胞型態及染色性亦與 FFPE 下不盡相同，細胞細節明顯較為不足，使其組織病理學分析不易進行⁴。

      綜觀而論，當今 MMA 包埋組織不論是切片製作技術或是病理分析上都有需要克服的多項難題。但因其能比傳統石蠟更好的保存硬組織的生化特性及結構，在骨代謝、植牙、骨材及牙材的研究領域有不可替代的重要性。且在 ISO 10993 的規範要求下，新興醫療材料於臨床前的安全性試驗中皆須進行塑膠包埋組織切片的分析，使塑膠包埋組織技術的需求的必然日益增加。

 

參考文獻

1. Amugongo, S. K. (2010). In Utero Sources of Skeletal Variation: the Role of Maternal Prenatal Stress. University of California, Berkeley.
2. Erben, R. G. (1997). Embedding of bone samples in methylmethacrylate: an improved method suitable for bone histomorphometry, histochemistry, and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 45(2), 307-313.
3. Musumeci, G. (2014). Past, present and future: overview on histology and histopathology. J Histol Histopathol, 1(5), 1-3.
4. Rousselle, S. D., Ramot, Y., Nyska, A., & Jackson, N. D. (2019). Pathology of bioabsorbable implants in preclinical studies. Toxicologic Pathology, 47(3), 358-378.
5. Wallin, R. F., & Upman, P. J. (1998). A practical guide to ISO 10993-6: implant effects. Medical Device and Diagnostic Industry, 20, 102-105.
6. Walsh, W., Pelletier, M. H., & Christou, C. (2016). The Bone: Implant Interface in Loaded and Unloaded Models. The Spine Journal, 16(10), S268.
7. Wong, F. T. S. (1985). An evaluation of various plastic embedding methods for preparing ground sections from calcified tissue with the Logitech system for light microscopy. Calcified tissue international, 37, 669-672.