實驗動物在 ISO10993 醫療器材 生物相容性試驗之應用與常見問題

曹銘陽 博士
亮宇生物科技股份有限公司

 

國際上，美國材料試驗協會ASTM與國際標準組織第 194 技術委員會（ISO/TC 194）對於生物相容性評價方法一直在更新。ISO/TC 194 自 1989 年成立以來，相繼制定了ISO10993《醫療器材生物學評價》系列標準。

ISO10993 系列為醫療器材上市前要執行的臨床前試驗主要依據規範，近幾年有相當多改版，也進一步顯示目前醫療器材在歐美國家申請的一些重點改變， 最明顯的一個改變便是 2018 年所改版的 10993-1，這是相當重要的一次改版，10993-1 主要描述在醫療器材進行風險評估時應該做哪些事，並依據這些結論來進行生物相容性試驗規劃，新版 ISO 10993-1 強調在生物學評價和材料表徵之前，必須收集器械/元件材料的物理和化學資訊。此類資訊的獲取是生物學評價的第一步，並為開展生物學測試之前提供充分的資訊依據。透過材料化學表徵和毒理學資料進行長期性生物學試驗能否豁免。新標準對於醫療器械的風險評價更加嚴格，由此可得知在醫療器材的臨床前試驗中，物理化學特徵的加強注重與動物試驗的減少使用是一個趨勢。

 

由於醫療器材種類很多，相對還是屬於高風險，目前動物試驗還是無法避免，可以看到表一之試驗規劃中，必要的第一步是收集醫材的物理和化學資訊，之後再依據這些資訊來規劃生物學試驗，這部分的試驗規劃與文件撰寫在 FDA 申請醫療器材上已經是必備的條件，但目前國內 CRO 公司對於這方面能力除了極少數公司外還是相當欠缺，畢竟這需要有化學實驗室，毒理評估，生物相容性實驗室與顧問能力。除此之外，還需要依照醫材的分類，人體接觸位置，接觸人體時間來規劃生物相容性試驗，表一可見幾乎都是動物試驗，其中又以敏感試驗和刺激試驗為動物試驗的基本要求，只要是醫療器材最基本就是要至少執行敏感試驗和刺激試驗，而除了 10993-1改版之外，最近10993-10 也改版，這是在敘述敏感試驗和刺激試驗的重要規範，改版除了增加很多非動物試驗的敘述，也將刺激試驗整個移到另一個 10993-23 規範，算是非常大幅的改版，所以就以這兩類試驗來介紹並分享國內實驗室執行上常見的問題，有些問題甚至是 FDA 審查實務上常見問題，動物試驗所費不低，為減少不必要的重作浪費，這些問題不可不注意。

 

刺激試驗
刺激試驗在 10993 系列規範中已經改版至 10993-23 中描述，原有的10993-10 中的刺激篇幅已經全數移除， 刺激試驗會依照醫療器材的臨床使用方式來規劃，包含皮內刺激，皮膚刺激， 眼刺激，口腔黏膜刺激與陰道刺激…等等，這些都是動物試驗，其中又以皮內刺激試驗最為常做，事實上在FDA審查實務上，即便是完好皮膚表面接觸類的醫療器材，只要接觸時間長達4小時以上，FDA會認為皮膚刺激試驗已經不符風險控管，會改要求執行皮內刺激試驗。

皮內刺激試驗是一個常常因為技術問題而導致偽陰性的試驗，由本試驗的名稱可得知要由皮內注射的方式執行， 但常常有技術不純熟的實驗室因為不熟皮內注射而變成皮下注射導致結果偽陰性，皮內注射最重要的是皮膚應該在注射完當下為腫脹的情況(如圖一)，這才是成功的皮內注射，此腫脹若為無刺激性，通常在一兩個小時後會消退，而規範有特別提到油類經由皮內注射後常有些許發炎反應 (圖二)，但我們卻常看到在國內皮內刺激試驗報告中的油類萃取組中竟然都全無反應，這表示常有實驗室的皮內注射不確實所導致。

圖一、皮內注射後之腫脹狀況

 

 

敏感試驗
敏感試驗主要使用動物是天竺鼠，實驗時間約莫 28天，原理是先利用誘發期在皮膚給予試驗物質的誘導，經過一段時間後再用試驗物質去測試皮膚是否有產生過敏反應。

敏感試驗主要有分成兩種方式，一個是天竺鼠極大化法 (Guinea pig maximization test)，一個是貼片法(Closed-patch test)，其中以天竺鼠極大化法為較能偵測出弱敏感物質，因此是最常執行的試驗。天竺鼠極大化法主要分成兩個誘發期 (induction)，第一個誘發期是利用試驗物質與佐劑 (Freund’s complete adjuvant) 混合後， 以皮內注射方式注射到天竺鼠進行誘導，待一段時間後進入第二誘發期，此時期會使用貼片方式將試驗物質貼到注射位置進行第二次誘導，關鍵在第二次誘導前要先以 SDS 進行皮膚的塗抹，待第二次誘導完成再等待一段時間後我們便可以用試驗物質來進行挑戰 (Challenge) 看是否真的誘導出過敏反應， 這時我們會使用其他未做試驗的皮膚區域來執行，一般來說，無論是試驗組或是對照組動物都應該進行試驗物質加上對照物質的貼片， 如下圖三，但 10993-10 於 2021 年 11 月改版後，允許如果是使用生理食鹽水或是植物油萃取的試驗物質，可以試驗組在挑戰期單貼試驗物質，而對照組在挑戰期單貼對照物質 (生理食鹽水或植物油) 即可，但這種貼片方式規範也有特別提醒可能容易有偽陽性的狀況，要特別注意，此外，在另一個化學品規範 OECD406 中，裡面描述的天竺鼠極大化法並沒有這個選擇，無論是試驗組或是對照組動物都應該進行試驗物質加上對照物質的貼片。

天竺鼠敏感試驗最擔憂的還有實驗室程序不熟悉造成的偽陰性，因此規範都有規定要定期每半年執行一次陽性對照試驗，這部分也是要別留意實驗室是否有確實執行並有測出陽性結果，一般來說規範都會以已知弱敏感物質當作陽性對照物，例如2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB) 。

10993-10 改版後針對非動物試驗的敏感試驗也多有著墨，列了非常多敏感替代試驗，可知動物試驗的替代試驗發展在各領域都有明顯地的加強，諸如化學品登錄也是多有討論，甚至有電腦 AI應用大數據的比對來推測毒理以減少動物試驗使用。

雖然物理化學特徵的加強與風險評估報告的被注重，以及動物試驗的減少使用是一個趨勢，但由於醫療器材與藥物的安全性來說風險還是相當高，因此短期內動物試驗是無法避免的，但為了減少不必要的動物使用，了解與正確執行各項試驗也是相當重要的課題，建議在試驗前，諮詢具有豐富經驗之公司或顧問。

參考文獻
1. ISO 10993-1:2018
2. ISO 10993-23:2021
3. ISO 10993-10:2021